目前主流的实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）方法主要分为染料法和探针法。染料法以SYBR Green为代表，SYBR Green染料在游离状态下荧光微弱，但一旦与双链DNA结合，荧光强度会大幅增强。因此，通过检测反应管中荧光强度，可以间接计算反应管中生成的双链DNA（PCR产物）的量。然而，该方法存在特异性不足的问题，可能会将非特异性扩增的产物计入结果。

探针法的荧光强度同样被用作检测PCR产物量的依据，但其发光机制与染料法迥然不同。荧光是一种光致发光现象，当特定波长的光照射于某种物质时，物质会吸收光能并被激发，从而发出比入射光波长更长的光。原理上，光子能量使原子中的电子从基态跃迁到更高的能级，而当电子返回基态时，能量以光的形式释放，形成荧光。

在荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）中，如果一个荧光基团（供体）发射光谱与另一个基团（受体）吸收光谱部分重叠，并且两者距离达到1-10纳米时，供体在激发后会将能量转移给受体，而不发出光，此过程由偶极子介导。在这种情况下，如果受体的荧光量子产率为零，则供体的荧光会被淬灭；若受体同样能够发光，则可以观察到受体的荧光和红移现象。

目前所有探针法qPCR的理论基础均基于荧光共振能量转移现象，探针上含有一对能够产生此种能量转移的基团。通过PCR反应中发生的酶切或杂交等过程，调节这两者之间的距离，最终影响荧光强度及类型，从而与PCR产物的种类和数量直接相关，通过这种方式可有效检测出PCR反应体系中的产物。

几种主要的qPCR探针法

1. Taq-Man探针

Taq-Man探针法是经典的探针方法，通过设计一条与扩增产物互补的探针，在其5'端标记荧光基团（供体），在3'端标记淬灭基团（受体）。在探针完整时，荧光与淬灭基团距离极近，因荧光共振能量转移使荧光基团不发光；但在PCR反应过程中，当引物引导的延伸反应到达探针位置，5'-3'外切酶活性作用下，探针被水解，导致荧光基团与淬灭基团的距离超出能量转移的范围，最终使荧光基团在适宜的激发光作用下发光。此探针的特异性保证了荧光种类和量能有效代表目标产物的种类与数量。

2. 双杂交探针

与Taq-Man法不同，双杂交探针的供体与受体分别位于两条探针上。这两条探针能够与扩增产物杂交，尽管杂交位置略有不同，但彼此相距颇近。在反应过程中，两条探针一头一尾杂交于扩增产物上，确保供体和受体的距离维持在10纳米内，使得供体在激发时不发生光发射，而受体发出荧光，从而确认扩增产物的存在。

3. 分子信标探针

分子信标探针通过增加荧光基团与淬灭基团的距离来实现荧光发光。与Taq-Man法不同，该探针不通过酶切，而是通过杂交改变探针的二级结构，使两个基团的距离变化，从而触发荧光的产生。探针在与靶序列杂交前呈现茎环结构，当靶序列产生后，环部分与靶序列结合，导致两臂间距离拉开，抑制荧光共振能量转移，进而使荧光基团发光。

4. 蝎形探针

蝎形探针，因外形类似蝎子而得名，其基本原理与分子信标探针相似。但蝎形探针的3'端附有PCR引物，生成的产物与探针为同一分子，实现快速而高效的杂交反应。

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