二、TOPO克隆PCR产物的纯化回收

1. PCR反应结束后，首先需进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确认是否存在目的大小的条带。

2. 建议采用切胶回收法进行纯化（切胶时间最好控制在3分钟内，以避免紫外线对DNA的损伤）。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收的浓度，确保浓度≥30ng/μl，并再次通过电泳确认仅存在目的条带。

3. 目的片段连接到载体时，按照说明书要求准备连接反应体系，每组分的投入体积应≥1μl。如浓度过高，可进行稀释；连接反应的温度可设置为25°C或37°C，时间可设为5分钟。如果出现克隆失败或得到空载体/假阳性结果，可考虑将时间延长至30分钟。

4. 感受态细胞转化与涂板过程：选择使用DH5α、Fast-T1等用于克隆的化学感受态细胞进行转化；感受态细胞不宜重复冻融，建议在-80°C取出后一次性使用。重组产物与感受态细胞体积的比例应为1:10，推荐将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或将5μl重组产物加入至50μl感受态细胞中进行热激转化，热激时间建议遵循感受态细胞的说明书操作。在涂板时，所用平板的抗生素应与转化载体的抗性相匹配。

5. 涂板前，先将菌液离心（2500×g，3分钟），用移液枪吸去多余的LB培养基，保留100μl重悬液后进行整体涂板，或吸取适合的体积进行涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1. 从平板中挑取体积适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落。

2. 多选择几个单克隆菌落进行鉴定分析。

3. 将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中，充分混匀后吸取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）的模板。

4. 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。

在处理模板中存在Amp/kana抗性的质粒时，应对目的片段进行切胶回收。

环亚集团致力于为生物医药领域提供高品质的产品和专业技术服务，努力发展成为基因治疗和细胞治疗领域的领军生物科技企业。总部位于广州，我们为全国客户提供前沿的专业资讯及完善的产品和物流服务。凭借专业的技术力量与丰富的人脉资源，环亚集团在全国主要城市拥有众多合作伙伴，荣幸地将世界先进的高科技产品推荐给致力于生物学研究的科研人员。此外，作为专业的产品供应商，环亚集团储备了大量现货，配合优秀的销售团队和专业的技术支持，随时为客户提供服务。